الاستخدام والاحتياطات لأنبوب الطرد المركزي للترشيح الفائق
1) اختر أنبوب الترشيح الفائق المناسب.لاحظ أن أغشية UF تختلف في مستوى تحملها للمواد الكيميائية المختلفة.عادة، يمكن اختيار أنابيب الترشيح الفائق ذات الوزن الجزيئي المقطوع 10 كيلو دالتون بقطع الوزن الجزيئي الذي لا ينبغي أن يكون أكبر من 1/3 الوزن الجزيئي للبروتين محل الاهتمام، مثل 35 كيلو دالتون.إذا كان الوزن الجزيئي للبروتين محل الاهتمام حوالي 10 دينار كويتي، يمكن استخدام أنبوب الترشيح الفائق مع قطع الوزن الجزيئي 3 دينار كويتي.
(2) يكون الترشيح الفائق، الذي تم شراؤه حديثًا، جافًا، مع إضافة الماء عالي النقاء قبل الاستخدام وتمرير الماء بالكامل عبر الغشاء أو حمام الثلج أو الثلاجة المبردة مسبقًا لبضع دقائق.ثم يتم سكب الماء، أي سائل البروتين، والكمية المضافة، أيهما لا يزيد عن الخط الأبيض الموجود في أعلى الأنبوب.العملية خفيفة، ويحتاج أنبوب الترشيح الفائق إلى التبريد المسبق على الجليد قبل إضافة محلول البروتين.
3) يجب أن تصل الكتلة ومركز الثقل إلى التوازن.لاحظ أن سرعة الدوران والتسارع ليسا سريعين جدًا، وإلا فسيؤدي ذلك إلى إتلاف غشاء الترشيح الفائق بشكل مباشر.بدأ الترشيح الفائق بالطرد المركزي (تم تبريد جهاز الطرد المركزي مسبقًا إلى 4 درجات).بعد تحويل عدد الدورات في الدقيقة لأجهزة الطرد المركزي المختلفة إلى g، كان الأمر مختلفًا.تم ضبط تسارع جهاز الطرد المركزي إلى الحد الأدنى، مما يقلل الضغط على الغشاء.ملحوظة: تأكد من مغادرة جهاز الطرد المركزي بعد وصول جهاز الطرد المركزي إلى سرعته المقصودة، أو إذا واجهتك مشكلة فلن تتمكن من التعامل معها للمرة الأولى.تم ضبط اتجاه الغشاء إلى المغزل وفقًا للتعليمات (حالة الطرد المركزي الزاوي هي غشاء على المحور العمودي).في الاستخدام العملي، تكون سرعة الدوران العامة أقل من تلك الواردة في التعليمات، بحيث يمكن إطالة عمر أنبوب الطرد المركزي.
3) يجب أن تصل الكتلة ومركز الثقل إلى التوازن.لاحظ أن سرعة الدوران والتسارع ليسا سريعين جدًا، وإلا فسيؤدي ذلك إلى إتلاف غشاء الترشيح الفائق بشكل مباشر.بدأ الترشيح الفائق بالطرد المركزي (تم تبريد جهاز الطرد المركزي مسبقًا إلى 4 درجات).بعد تحويل عدد الدورات في الدقيقة لأجهزة الطرد المركزي المختلفة إلى g، كان الأمر مختلفًا.تم ضبط تسارع جهاز الطرد المركزي إلى الحد الأدنى، مما يقلل الضغط على الغشاء.ملحوظة: تأكد من مغادرة جهاز الطرد المركزي بعد وصول جهاز الطرد المركزي إلى سرعته المقصودة، أو إذا واجهتك مشكلة فلن تتمكن من التعامل معها للمرة الأولى.تم ضبط اتجاه الغشاء إلى المغزل وفقًا للتعليمات (حالة الطرد المركزي الزاوي هي غشاء على المحور العمودي).في الاستخدام العملي، تكون سرعة الدوران العامة أقل من تلك الواردة في التعليمات، بحيث يمكن إطالة عمر أنبوب الطرد المركزي.
(4) عند التركيز على 1 مل المتبقي، خذ 50 ميكروليتر من المحلول المنظم، وأضف 10 ميكروليتر من التدفق من خلاله وانظر ما إذا كان هناك أي لون أزرق، كحكم على ما إذا كان أنبوب الترشيح الفائق يفتقد البروتين.إذا كان الأنبوب متسربًا، قم بإعادة صب الطبقة العليا وتدفقها في أنبوب جديد لبدء الترشيح الفائق.لتحديد ما إذا كانت الأنابيب قد تم تفويتها بدقة، قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق مع 5 ملجم مل من BSA قبل التدفق، أو تشغيله على غراء البروتين، أو مقايسة خام برادفورد، واستمر بإضافة محلول البروتين المركز المتبقي (الذي يعمل على الجليد ويمنع البروتينات من التسخين) حتى تمت إضافة كل التركيز.توخي الحذر أثناء الطرد المركزي في حالة حدوث هطول الأمطار من البروتينات، مما يؤدي إلى إغلاق الأنبوب.في حالة حدوث هطول الأمطار، تحديد ما إذا كان السبب المحدد لهطول الأمطار هو تركيز البروتين المفرط أو مخزن مؤقت غير مناسب؛يمكن حل المشكلة الأولى عن طريق الترشيح الفائق لأنابيب الترشيح الفائق المتعددة في وقت واحد، مما يؤدي إلى تقليل التركيز، ويمكن حل المشكلة الأخيرة عن طريق تبادل محاليل عازلة مختلفة حتى لا يحدث أي ترسيب للبروتين.
(4) عند التركيز على 1 مل المتبقي، خذ 50 ميكروليتر من المحلول المنظم، وأضف 10 ميكروليتر من التدفق من خلاله وانظر ما إذا كان هناك أي لون أزرق، كحكم على ما إذا كان أنبوب الترشيح الفائق يفتقد البروتين.إذا كان الأنبوب متسربًا، قم بإعادة صب الطبقة العليا وتدفقها في أنبوب جديد لبدء الترشيح الفائق.لتحديد ما إذا كانت الأنابيب قد تم تفويتها بدقة، قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق مع 5 ملجم مل من BSA قبل التدفق، أو تشغيله على غراء البروتين، أو مقايسة خام برادفورد، واستمر بإضافة محلول البروتين المركز المتبقي (الذي يعمل على الجليد ويمنع البروتينات من التسخين) حتى تمت إضافة كل التركيز.توخي الحذر أثناء الطرد المركزي في حالة حدوث هطول الأمطار من البروتينات، مما يؤدي إلى إغلاق الأنبوب.في حالة حدوث هطول الأمطار، تحديد ما إذا كان السبب المحدد لهطول الأمطار هو تركيز البروتين المفرط أو مخزن مؤقت غير مناسب؛يمكن حل المشكلة الأولى عن طريق الترشيح الفائق لأنابيب الترشيح الفائق المتعددة في وقت واحد، مما يؤدي إلى تقليل التركيز، ويمكن حل المشكلة الأخيرة عن طريق تبادل محاليل عازلة مختلفة حتى لا يحدث أي ترسيب للبروتين.
(5) يتم استخدام الخطوات القليلة الأولى لتركيز البروتين، وإذا كان سيتم تغيير المخزن المؤقت، أضف بلطف المخزن المؤقت الجديد (الترشيح الفائق من خلال غشاء الترشيح الفائق 0.22 ميكرومتر) إلى حوالي 1 مل من البروتين الكلي، وأعد التركيز إلى حوالي 1 مل لمدة ثلاثة مرات متتالية، مع الحجم النهائي المركز النهائي اعتمادًا على تركيز البروتين المطلوب، بشكل عام لا يزيد عن 500ul، ولكن أيضًا في حدود 200ul.حقق 1000 × أو أكثر في ثلاث مناسبات، وهو نفس القدر من التغيير في المخزن المؤقت، كما تم حسابه بما لا يقل عن 10 × أو نحو ذلك من إثراء الحجم في كل مرة.
(5) يتم استخدام الخطوات القليلة الأولى لتركيز البروتين، وإذا كان سيتم تغيير المخزن المؤقت، أضف بلطف المخزن المؤقت الجديد (الترشيح الفائق من خلال غشاء الترشيح الفائق 0.22 ميكرومتر) إلى حوالي 1 مل من البروتين الكلي، وأعد التركيز إلى حوالي 1 مل لمدة ثلاثة مرات متتالية، مع الحجم النهائي المركز النهائي اعتمادًا على تركيز البروتين المطلوب، بشكل عام لا يزيد عن 500ul، ولكن أيضًا في حدود 200ul.حقق 1000 × أو أكثر في ثلاث مناسبات، وهو نفس القدر من التغيير في المخزن المؤقت، كما تم حسابه بما لا يقل عن 10 × أو نحو ذلك من إثراء الحجم في كل مرة.
وقت النشر: 09 نوفمبر 2022