التشخيص الجزيئي، تقنية ومبدأ PCR شائع الاستخدام

تفاعل البوليميراز المتسلسل، هو تفاعل البوليميراز المتسلسل، والذي يشير إلى إضافة dNTP وMg2+ وعوامل الاستطالة وعوامل تعزيز التضخيم إلى النظام تحت تحفيز بوليميريز الحمض النووي، وذلك باستخدام الحمض النووي الأصلي كقالب والبادئات المحددة كنقطة بداية للتمديد، من خلال خطوات التمسخ، والتليين، والتمديد، وما إلى ذلك، فإن عملية تكرار الحمض النووي لشريط الحمض النووي المكمل لقالب الشريط الأصلي في المختبر يمكن أن تعمل بسرعة وبشكل خاص على تضخيم أي حمض نووي مستهدف في المختبر.

1. بداية ساخنة PCR

وقت بدء التضخيم في PCR التقليدي ليس وضع جهاز PCR في جهاز PCR، ثم يبدأ البرنامج في التضخيم.عند اكتمال تكوين النظام، يبدأ التضخيم، مما قد يتسبب في تضخيم غير محدد، ويمكن لـ PCR البدء السريع حل هذه المشكلة.

ما هو البدء الساخن PCR؟بعد إعداد نظام التفاعل، يتم إطلاق معدل الإنزيم عند درجة حرارة عالية (عادة أعلى من 90 درجة مئوية) أثناء مرحلة التسخين الأولية للتفاعل أو مرحلة "البدء الساخن"، بحيث يتم تنشيط بوليميراز الحمض النووي.يعتمد وقت التنشيط الدقيق ودرجة الحرارة على طبيعة بوليميراز الحمض النووي ومعدل البدء الساخن.تستخدم هذه الطريقة بشكل أساسي المعدلات مثل الأجسام المضادة، أو روابط التقارب، أو المعدلات الكيميائية لمنع نشاط بوليميراز الحمض النووي.نظرًا لأن نشاط بوليميراز الحمض النووي يتم تثبيطه في درجة حرارة الغرفة، فإن تقنية البدء الساخن توفر راحة كبيرة لإعداد أنظمة تفاعل PCR متعددة في درجة حرارة الغرفة دون التضحية بخصوصية تفاعلات PCR.

2. RT-PCR

RT-PCR (النسخ العكسي PCR) هي تقنية تجريبية للنسخ العكسي من mRNA إلى cDNA واستخدامها كقالب للتضخيم.الإجراء التجريبي هو استخراج الحمض النووي الريبي الكلي في الأنسجة أو الخلايا أولاً، واستخدام Oligo (dT) كتمهيد، واستخدام النسخ العكسي لتجميع cDNA، ثم استخدام cDNA كقالب لتضخيم PCR للحصول على الجين المستهدف أو الكشف عن التعبير الجيني.

3. الفلورسنت الكمي PCR

الفلورسنت الكمي PCR (في الوقت الحقيقي PCR الكمي،رت-قبكر) يشير إلى طريقة إضافة مجموعات الفلورسنت إلى نظام تفاعل PCR، وذلك باستخدام تراكم إشارات الفلورسنت لمراقبة عملية PCR بأكملها في الوقت الحقيقي، وأخيرا استخدام المنحنى القياسي لتحليل القالب كميا.تتضمن طرق qPCR شائعة الاستخدام SYBR Green I وTaqMan.

4. متداخل PCR

يشير PCR المتداخل إلى استخدام مجموعتين من بادئات PCR لجولتين من تضخيم PCR، ومنتج التضخيم في الجولة الثانية هو جزء الجين المستهدف.

إذا أدى عدم تطابق الزوج الأول من البادئات (البادئات الخارجية) إلى تضخيم منتج غير محدد، فإن احتمال التعرف على نفس المنطقة غير المحددة بواسطة الزوج الثاني من البادئات والاستمرار في التضخيم يكون صغيرًا جدًا، وبالتالي فإن التضخيم بواسطة الزوج الثاني من الاشعال، تم تحسين خصوصية PCR.تتمثل إحدى ميزات إجراء جولتين من تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنه يساعد على تضخيم المنتج الكافي من الحمض النووي المحدود المبدئي.

5. هبوط PCR

يعد Touchdown PCR طريقة لتحسين خصوصية تفاعل PCR عن طريق ضبط معلمات دورة PCR.

في هبوط PCR، يتم ضبط درجة حرارة التلدين للدورات القليلة الأولى ببضع درجات أعلى من درجة حرارة التلدين القصوى (Tm) للبادئات.يمكن أن تؤدي درجة حرارة التلدين المرتفعة إلى تقليل التضخيم غير المحدد بشكل فعال، ولكن في الوقت نفسه، سيؤدي ارتفاع درجة حرارة التلدين إلى تفاقم فصل الاشعال والتسلسلات المستهدفة، مما يؤدي إلى انخفاض إنتاجية PCR.ولذلك، في الدورات القليلة الأولى، عادة ما يتم ضبط درجة حرارة التلدين على الانخفاض بمقدار 1 درجة مئوية لكل دورة لزيادة محتوى الجين المستهدف في النظام.عندما يتم خفض درجة حرارة التلدين إلى درجة الحرارة المثلى، يتم الحفاظ على درجة حرارة التلدين للدورات المتبقية.

6. تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر

يشير PCR المباشر إلى تضخيم الحمض النووي المستهدف مباشرة من العينة دون الحاجة إلى عزل الحمض النووي وتنقيته.

هناك نوعان من PCR المباشر:

الطريقة المباشرة: أخذ كمية صغيرة من العينة وإضافتها مباشرة إلى PCR Master Mix للتعرف على PCR؛

طريقة التكسير: بعد أخذ عينة من العينة، أضفها إلى المحللة، ثم أطلق الجينوم، ثم خذ كمية صغيرة من المادة الطافية المتحللة وأضفها إلى PCR Master Mix، وقم بإجراء التعرف على PCR.يعمل هذا النهج على تبسيط سير العمل التجريبي، ويقلل من وقت التدريب العملي، ويتجنب فقدان الحمض النووي أثناء خطوات التنقية.

7. الشركات المملوكة للدولة PCR

يستخدم الربط الجيني عن طريق تمديد التداخل PCR (SOE PCR) الاشعال مع نهايات تكميلية لجعل منتجات PCR تشكل سلاسل متداخلة، بحيث في تفاعل التضخيم اللاحق، من خلال تمديد السلاسل المتداخلة، مصادر مختلفة لتقنية A التي تتداخل فيها الأجزاء المضخمة وتقسم معا.تحتوي هذه التكنولوجيا حاليًا على اتجاهين رئيسيين للتطبيق: بناء الجينات الاندماجية؛طفرة الجينات الموجهة نحو الموقع.

8. إي بي سي آر

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (IPCR) بادئات تكميلية عكسية لتضخيم أجزاء الحمض النووي بخلاف البادئتين، وتضخيم التسلسلات غير المعروفة على جانبي جزء الحمض النووي المعروف.

تم تصميم IPCR في الأصل لتحديد تسلسل المناطق المجاورة غير المعروفة، ويستخدم في الغالب لدراسة تسلسل محفز الجينات؛إعادة ترتيب الكروموسومات الجينية، مثل دمج الجينات، والانتقال والتبديل؛وتكامل الجينات الفيروسية، تُستخدم أيضًا بشكل شائع الآن من أجل الطفرات الموجهة نحو الموقع، قم بنسخ البلازميد مع الطفرة المرغوبة.

9. دي بي سي آر

PCR الرقمي (dPCR) هو تقنية للتقدير الكمي المطلق لجزيئات الحمض النووي.

توجد حاليًا ثلاث طرق لتقدير جزيئات الحمض النووي.يعتمد القياس الضوئي على امتصاص جزيئات الحمض النووي؛يعتمد PCR الكمي الفلورسنت في الوقت الحقيقي (PCR في الوقت الحقيقي) على قيمة Ct، وتشير قيمة Ct إلى رقم الدورة المطابق لقيمة التألق التي يمكن اكتشافها؛PCR الرقمي هو أحدث التقنيات الكمية التي تعتمد على طريقة PCR أحادية الجزيء لحساب كمية الحمض النووي وهي طريقة كمية مطلقة.